荧光素FITC标记抗体的方法

1、 FITC的性质

FITC（异硫氰酸荧光素）呈黄色橙黄色或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存两年以上，在低温中可保存多年。 易溶于水和酒精。最大吸收光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为398.4。
    当FITC在碱性溶液（pH8.5以上）中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个BSA分子中有86个氨基残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下：

FITC-N=C=S  +  NH2-蛋白质  →  FITC-NH-CS-NH-蛋白质

2、抗体的准备 

称取一定量的IgG于烧杯中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后浓度为2mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。

3、荧光素的准备 

根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

4、结合反应

边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角瓶壁或搅拌玻璃棒上（大约5~10min内加完）。加毕后，继续搅拌12~18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃冰箱中。

结合完毕后，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0~4℃）过夜，然后将溶液离心（3000rpm）20min，除去其中少量的沉淀物。取透析过夜的标记物，过葡萄糖凝胶G-25或G-50柱，分装、贮存于4℃冰箱或冰库中。

5、标记抗体的保存
     以0~4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白质变性。最好加入浓度为（1:5000）~（1:10000）的硫柳汞或（1：1000）~（1:5000）的叠氮钠防腐，小量分装如0.1~1mL，真空干燥后更易长期保存。