1.cDNA编码区片段的PCR扩增50ul ×2
模版 1
5‘引物 1
3‘引物 1
dNTP 1
10×buffer 5
Taq 1
Milliq H2O 40
2．PCR产物纯化
1、加5倍体积的PB
2、将Spin柱放于2ml收集管上
3、加样液，14Krpm，离心1min
4、弃去排出液
5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min
6、弃去排出液,14Krpm,离心1min
7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中
8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm，离心1min
3．双酶切
载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n小时）：
载体 10ul PCR产物 20ul
10x buffer 3ul 10x buffer 3u